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Science|CRISPR-Cas13編輯RNA
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Original: https://baijiahao.baidu.com/s?id=17505522511042620

在RNA水平,核酸編輯可以修復(fù)疾病相關(guān)的序列產(chǎn)生功能性蛋白質(zhì),這有望治療遺傳疾病。VI型CRISPR-Cas系統(tǒng)包含可編程的單效應(yīng)RNA引導(dǎo)的RNase Cas13。在這里,研究者對VI型系統(tǒng)進(jìn)行了分析,以設(shè)計出一種能夠穩(wěn)健敲除的Cas13直系同源物,并通過使用催化失活的Cas13將腺苷轉(zhuǎn)為肌苷脫氨酶活性通過ADAR2引導(dǎo)至哺乳動物細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄物來證明RNA編輯。該系統(tǒng)被稱為可編程A到I替換的RNA編輯(REPAIR),沒有嚴(yán)格的序列限制,可用于編輯包含致病性突變的全長轉(zhuǎn)錄本。研究者進(jìn)一步設(shè)計該系統(tǒng),以創(chuàng)建高特異性變體REPAIRv2,該變體的特異性是REPAIRv1的919倍,并最小化該系統(tǒng)以減輕病毒傳播。REPAIR為研究、治療和生物技術(shù)提供了一個前景廣闊的RNA編輯平臺。

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綜述

精確的核酸編輯技術(shù)對于研究細(xì)胞功能和作為新的治療方法是有價值的。當(dāng)前的編輯工具基于可編程核酸酶,如原核簇狀規(guī)則間隔短回文重復(fù)序列(CRISPR)相關(guān)核酸酶Cas9(1-4)或Cpf1(5),這反過來通過非同源末端連接(NHEJ)或通過模板依賴同源定向修復(fù)(HDR)的精確基因編輯來驅(qū)動靶向基因斷裂(6)。NHEJ利用在分裂細(xì)胞和有絲分裂后細(xì)胞中都活躍的宿主機(jī)制,并通過產(chǎn)生插入或缺失(indel)突變的混合物來提供有效的基因破壞。相比之下,HDR是由宿主機(jī)制介導(dǎo)的,其表達(dá)主要局限于復(fù)制細(xì)胞。因此,開發(fā)有絲分裂后細(xì)胞的基因編輯能力仍然是一個主要挑戰(zhàn)。由Cas9尼克酶和胞苷脫氨酶之間的融合組成的DNA堿基編輯器可以在靶窗內(nèi)介導(dǎo)有效的胞苷到尿苷的轉(zhuǎn)化,并顯著減少雙鏈斷裂誘導(dǎo)的indels的形成(7,8)。然而,DNA堿基編輯的潛在靶向位點受限于Cas9對編輯位點原間隔物相鄰基序(PAM)的要求(9)。在此,研究者描述了使用VI型CRISPR相關(guān)RNA引導(dǎo)的RNA酶Cas13(10-13)開發(fā)精確靈活的RNA堿基編輯技術(shù)。

Cas13酶具有兩個高級真核生物和原核生物核苷酸結(jié)合(HEPN)內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域,它們介導(dǎo)精確的RNA切割,優(yōu)先選擇在生物化學(xué)和細(xì)菌中觀察到的具有原間隔物側(cè)翼位點(PFS)基序的靶(10,11)。迄今已鑒定出三個Cas13蛋白家族:Cas13a(以前稱為C2c2)、Cas13b和Cas13c(12,13)。研究者最近報道,Cas13a酶可以用作核酸檢測(14)以及哺乳動物和植物細(xì)胞RNA敲除和轉(zhuǎn)錄物追蹤(15)的工具。有趣的是,RNA干擾Cas13a不需要生物化學(xué)PFS(15)。Cas13酶的可編程性質(zhì)使其成為開發(fā)RNA結(jié)合和干擾應(yīng)用工具的一個有吸引力的起點。

作用于RNA(ADAR)家族酶的腺苷脫氨酶通過腺苷水解脫氨化為肌苷(一種在翻譯和剪接功能上等同于鳥苷的核堿)介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄物的內(nèi)源性編輯(16,17)。有兩個功能性的人ADAR同源基因ADAR1和ADAR2,它們由N端雙鏈RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和C端催化脫氨基結(jié)構(gòu)域組成。ADAR1和ADAR2的內(nèi)源性靶位點包含大量的雙鏈同一性,催化結(jié)構(gòu)域需要雙鏈區(qū)域,以便在體外和體內(nèi)進(jìn)行有效編輯(18,19)。重要的是,ADAR催化結(jié)構(gòu)域能夠在體外無任何蛋白質(zhì)輔因子的情況下脫氨靶腺苷(20)。已發(fā)現(xiàn)ADAR1主要針對重復(fù)區(qū)域,而ADAR2主要針對非重復(fù)編碼區(qū)域(17)。盡管ADAR蛋白具有可限制靶向潛在靈活性的優(yōu)選編輯基序,但超活性突變體,如ADAR2(E488Q)(21),可以放松序列限制,提高腺苷對肌苷的編輯率。ADAR優(yōu)先對RNA雙鏈體中與胞苷堿基錯配的腺苷脫氨化(22),為精確的堿基編輯提供了一個有希望的機(jī)會。盡管先前的方法已經(jīng)通過RNA導(dǎo)向器設(shè)計了靶向ADAR融合(23-26),但尚未報道這些方法的特異性,它們各自的靶向機(jī)制依賴于RNA-RNA雜交,而無需蛋白伴侶的幫助,這可能會增強(qiáng)靶向識別和嚴(yán)格性。

在這里,研究者測定了哺乳動物細(xì)胞中RNA敲除活性的Cas13酶家族的一個子集,并鑒定了Prevotella sp.P5-125(PspCas13b)的Cas13b同源物是哺乳動物細(xì)胞應(yīng)用中最有效和最特異的。然后,研究者將ADAR2脫氨酶結(jié)構(gòu)域(ADAR2DD)與催化失活的PspCas13b融合,并證明RNA編輯可編程A到I(G)替換(REPAIR)報告和內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物以及與疾病相關(guān)的突變。最后,研究者采用了一種合理的誘變方案來提高dCas13b-ADAR2DD融合的特異性,以產(chǎn)生具有919倍以上特異性的REPAIRv2。

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結(jié)果

哺乳動物細(xì)胞中Cas13家族成員

研究者之前開發(fā)了用于哺乳動物敲除應(yīng)用的LwaCas13a,但它需要單體超折疊GFP(msfGFP)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域來有效敲除,盡管特異性很高,但敲除水平并不始終低于50%(15)。研究者試圖通過表征一組具有遺傳多樣性的Cas13家族成員,以評估其在哺乳動物細(xì)胞中的RNA敲除活性,來鑒定一種更穩(wěn)健的RNA靶向CRISPR系統(tǒng)(圖1A)。研究者生成了多種Cas13蛋白的哺乳動物密碼子優(yōu)化版本,包括21個Cas13a的同源基因、15個Cas13b的同源基因和7個Cas13c的同源基因,并將它們克隆到具有N端和C端核輸出信號(NES)序列和C端msfGFP的表達(dá)載體中,以增強(qiáng)蛋白穩(wěn)定性(補充表1)。為了測定哺乳動物細(xì)胞中的干擾,研究者設(shè)計了一種雙報告構(gòu)建體,在單獨的啟動子下表達(dá)獨立的Gaussia(Gluc)和Cypridinia(Cluc)熒光素酶,這允許一種熒光素酶作為Cas13干擾活性的測量,另一種作為內(nèi)部對照。對于每個Cas13同源物,研究者使用氨芐青霉素干擾試驗(圖S1;補充表2;補充信息)得出的Cas13b PFS基序和先前Cas13a活性報告中的3'H(非G)PFS設(shè)計了原間隔物側(cè)翼位點(PFS)兼容的導(dǎo)向RNA(10)。

研究者用Cas13表達(dá)、引導(dǎo)RNA和報告質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞,然后在48小時后量化Cas13表達(dá)水平和靶向Gluc(圖1B,圖S2A)。測試每個Cas13同源物的兩個引導(dǎo)RNA揭示了一系列活性水平,包括五個Cas13b同源物,相對于最近表征的LwaCas13a,兩個引導(dǎo)RNAs的干擾相似或增加(圖1B),研究者觀察到Cas13表達(dá)和干擾活性之間只有微弱的相關(guān)性(圖S2B–D)。研究者選擇了排名前五的Cas13b正交測井儀,以及排名前兩的Cas13a正交測井儀進(jìn)行進(jìn)一步的工程設(shè)計。

接下來,研究者測試了不含msfGFP的Cas13介導(dǎo)的Gluc的敲除,以選擇不需要穩(wěn)定結(jié)構(gòu)域的同源物來實現(xiàn)穩(wěn)健的活性。研究者假設(shè)Cas13活性可能受到亞細(xì)胞定位的影響,正如研究者先前報道的LwaCas13a的優(yōu)化(15)。因此,研究者測試了七個選擇的Cas13同源物C端融合到六個不同定位標(biāo)簽之一的干擾活性,而不含msfGFP。使用熒光素酶報告物分析,研究者確定了干擾活性最高的前三個Cas13b設(shè)計:來自Prevotella sp.P5-125(PspCas13b)的Cas13b和來自與HIV Rev基因NES融合的古斑紫菜(PguCas13b)C端的Cas13a和來自鴨疫里氏桿菌(RanCas13b,C端與MAPK NES融合(圖S3A)。為了進(jìn)一步區(qū)分頂部同源物的活性水平,研究者將三種優(yōu)化的Cas13b構(gòu)建體與優(yōu)化的LwaCas13a-msfGFP融合體以及shRNA進(jìn)行了比較,以了解它們使用位置匹配指南敲低內(nèi)源性KRAS轉(zhuǎn)錄物的能力(圖S3B)。研究者觀察到PspCas13b的最高水平干擾(平均敲除率為62.9%),因此選擇該干擾與LwaCas13a進(jìn)行進(jìn)一步比較。

為了更嚴(yán)格地定義PspCas13b和LwaCas13a的活性,研究者設(shè)計了沿著Gluc和Cluc轉(zhuǎn)錄物的位置匹配指南,并使用研究者的熒光素酶報告物測定法測定了它們的活性。研究者分別測試了93個和20個針對Gluc和Cluc的位置匹配指南,并發(fā)現(xiàn)PspCas13b相對于LwaCas13a的敲除水平持續(xù)增加(PspCas13 b的平均敲除率為92.3%,而LwaCas13a的平均敲減率為40.1%)(圖1C,D)。


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Cas13的干擾特異性

為了表征PspCas13b和LwaCas13a的干擾特異性,研究者設(shè)計了一個熒光素酶靶的質(zhì)粒庫,其包含整個靶序列和三個側(cè)翼5’和3’堿基對的單錯配和雙錯配(圖S3C)。研究者用LwaCas13a或PspCas13b轉(zhuǎn)染HEK293FT細(xì)胞,這是一種靶向未修飾靶序列的固定導(dǎo)向RNA,以及與適當(dāng)系統(tǒng)相對應(yīng)的錯配靶文庫。然后,研究者對未分離的轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行靶向RNA測序,以量化失配靶序列的缺失。研究者發(fā)現(xiàn),LwaCas13a和PspCas13b的中心區(qū)域?qū)蝹€失配相對不耐受,從PspCas13 b靶的12–26堿基對延伸到LwaCas13 a靶的13–24堿基對(圖S3D)。與單突變相比,雙失配的耐受性甚至更低,在更大的窗口內(nèi)幾乎沒有觀察到敲除活性,從PspCas13b的12–29堿基對和LwaCas13a的8–27堿基對延伸到它們各自的靶點(圖S3E)。此外,由于靶序列5'和3'端側(cè)翼的三個核苷酸存在失配,研究者可以評估PFS對Cas13敲除活性的限制。測序表明,幾乎所有的PFS組合都允許穩(wěn)健的敲除,這表明無論是哪種酶,哺乳動物細(xì)胞中的干擾都可能不存在PFS限制。這些結(jié)果表明,Cas13a和Cas13b顯示出相似的序列約束和對失配的敏感性。

研究者接下來描述了PspCas13b和LwaCas13a在轉(zhuǎn)錄組mRNA部分的干擾特異性。研究者進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組范圍的mRNA測序,以檢測顯著的差異表達(dá)基因。LwaCas13a和PspCas13b顯示了Gluc的強(qiáng)大敲除(圖1E,F(xiàn)),并且與位置匹配的shRNA相比具有高度特異性,shRNA顯示了數(shù)百個非靶點(圖1G),這與研究者先前對哺乳動物細(xì)胞中LwaCas13 a特異性的描述一致(15)。

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Cas13-ADAR靶向RNA編輯

鑒于PspCas13b在哺乳動物細(xì)胞中實現(xiàn)了一致、穩(wěn)健和特異性的mRNA敲除,研究者設(shè)想它可以作為RNA結(jié)合平臺來招募RNA修飾結(jié)構(gòu)域,如ADAR的脫氨酶結(jié)構(gòu)域(ADARDD),用于可編程RNA編輯。為了設(shè)計缺乏核酸酶活性的PspCas13b(dPspCas13b,以下稱為dCas13b),研究者突變了HEPN結(jié)構(gòu)域中的保守催化殘基,并觀察到熒光素酶RNA敲除的損失(圖S4A)。研究者假設(shè)dCas13b-ADARDD融合體可以被引導(dǎo)RNA招募到靶向腺苷,雜交RNA產(chǎn)生ADAR活性所需的雙鏈底物(圖2A)。為了提高靶腺苷脫氨率,研究者對最初的RNA編輯設(shè)計進(jìn)行了兩項額外的修改:研究者引入了與靶腺苷相對的錯配胞苷,此前有報道稱其可增加脫氨頻率,并將dCas13b與含有超活化突變的人ADAR1或ADAR2的脫氨酶結(jié)構(gòu)域融合以增強(qiáng)催化活性(ADAR1DD(E1008Q)(27)或ADAR2DD(E488Q)(21))。

為了測試dCas13b ADARDD的活性,研究者通過引入無義突變(W85X(UGG->UAG))在Cluc上生成了一個RNA編輯報告子,該突變可以通過a->I編輯在功能上修復(fù)為野生型密碼子(圖2B),然后作為Cluc發(fā)光的恢復(fù)進(jìn)行檢測。研究者在靶腺苷上用長度為30、50、70或84個核苷酸的間隔物均勻平鋪引導(dǎo)物,以確定最佳引導(dǎo)物放置和設(shè)計(圖2C)。研究者發(fā)現(xiàn),dCas13b-ADAR1DD需要更長的導(dǎo)管來修復(fù)Cluc報告器,而dCas13b-ADAR2DD在所有導(dǎo)管長度測試時都能正常工作(圖2C)。研究者還發(fā)現(xiàn),由于野生型ADAR2DD的熒光素酶修復(fù)減少,過度活躍的E488Q突變提高了編輯效率(圖S4B)。從這一活性證明中,研究者選擇dCas13b-ADAR2DD(E488Q)進(jìn)行進(jìn)一步表征,并將此方法命名為RNA編輯用于可編程A到I替換版本1(REPAIRv1)。

為了驗證熒光素酶活性的恢復(fù)是由于真實的編輯事件,研究者通過逆轉(zhuǎn)錄和靶向下一代測序直接測量了REPAIRv1介導(dǎo)的Cluc轉(zhuǎn)錄物編輯。研究者測試了目標(biāo)部位周圍的30和50 nt間隔物,發(fā)現(xiàn)兩種引導(dǎo)長度都產(chǎn)生了預(yù)期的A到I編輯,50 nt間隔器實現(xiàn)了更高的編輯百分比(圖2D,E,圖S4C)。研究者還觀察到,50個nt間隔物在測序窗口內(nèi)的非靶向腺苷處編輯的傾向增加,這可能是由于雙鏈RNA的區(qū)域增加(圖2E,圖S4C)。

接下來,研究者將靶向內(nèi)源性基因PPIB。研究者設(shè)計了50個nt間隔物平鋪PPIB,并發(fā)現(xiàn)研究者可以以高達(dá)28%的編輯效率編輯PPIB轉(zhuǎn)錄物(圖S4D)。為了測試REPAIR是否可以進(jìn)一步優(yōu)化,研究者修改了dCas13b和ADAR2DD(E488Q)之間的連接子(圖S4E,補充表3),并發(fā)現(xiàn)連接子的選擇適度影響了熒光素酶活性的恢復(fù)。此外,研究者測試了dCas13b和guide單獨介導(dǎo)編輯事件的能力,發(fā)現(xiàn)編輯需要ADAR脫氨酶結(jié)構(gòu)域(圖S5A–D)。

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定義RNA編輯序列

考慮到研究者可以在測試點實現(xiàn)精確的RNA編輯,研究者想描述針對轉(zhuǎn)錄組中任何RNA靶點編程系統(tǒng)的序列約束。序列限制可能來自dCas13b靶向限制,如PFS,或ADAR序列偏好(28)。為了研究對REPAIRv1的PFS限制,研究者設(shè)計了一個質(zhì)粒庫,在Cluc轉(zhuǎn)錄物的靶位點的5'端攜帶一系列四個隨機(jī)核苷酸(圖3A)。研究者以UAG或AAC基序中的中心腺苷為目標(biāo),發(fā)現(xiàn)對于這兩個基序,所有PFS都顯示出可檢測到的RNA編輯水平,大多數(shù)PFS在目標(biāo)位點的編輯率超過50%(圖3B)。接下來,研究者試圖確定REPAIRv1中的ADAR2DD是否有任何序列限制直接位于目標(biāo)堿基的側(cè)翼,如先前關(guān)于ADAR2DD的報道(28)。研究者測試了直接圍繞靶腺苷的5'和3'側(cè)翼核苷酸的每種可能組合(圖3C),并發(fā)現(xiàn)REPAIRv1能夠編輯所有基序(圖3D)。最后,研究者分析了間隔序列中與靶A相對的堿基的身份是否影響了編輯效率,并發(fā)現(xiàn)A–C錯配具有最高的熒光素酶恢復(fù),與先前關(guān)于ADAR2活性的報道一致,其中A–G、A–U和A-A顯著降低了REPAIRv1活性(圖S5E)。



使用REPAIRv1糾正與疾病相關(guān)的人類突變

為了證明REPAIRv1系統(tǒng)在哺乳動物細(xì)胞RNA編輯中的廣泛適用性,研究者設(shè)計了針對兩種疾病相關(guān)突變的REPAIRv1指南:X連鎖腎病性尿崩癥中的878G>A(AVPR2 W293X)和范科尼貧血中的1517G>A(FANCC W506X)。研究者將攜帶這些突變的基因的cDNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到HEK293FT細(xì)胞中,并測試REPAIRv1是否能糾正突變。使用含有50個nt間隔物的引導(dǎo)RNA,研究者能夠?qū)崿F(xiàn)AVPR2的35%校正和FANCC的23%校正(圖4A–D)。然后,研究者測試了REPAIRv1糾正34種不同疾病相關(guān)G>A突變的能力(補充表4),發(fā)現(xiàn)研究者能夠在33個位點實現(xiàn)顯著編輯,編輯效率高達(dá)28%(圖4E)。研究者選擇的突變只是ClinVar數(shù)據(jù)庫中致病性G到a突變(5739)的一部分,其中還包括額外的11943個G到a變體(圖4F和圖S6)。由于沒有序列限制(圖3),REPAIRv1能夠潛在地編輯所有這些與疾病相關(guān)的突變,特別是考慮到研究者觀察到的編輯與目標(biāo)基序無關(guān)(圖3C和圖4G)。

向患病細(xì)胞遞送REPAIRv1系統(tǒng)是治療用途的先決條件,因此研究者尋求設(shè)計可包裝成治療相關(guān)病毒載體(如腺相關(guān)病毒(AAV)載體)的REPAIRv1構(gòu)建體。AAV載體的包裝極限為4.7kb,不能容納大尺寸的dCas13b-ADARDD(4473bp)以及啟動子和表達(dá)調(diào)控元件。為了減小尺寸,研究者測試了與ADAR2DD(E488Q)融合的dCas13的各種N端和C端截短片段的RNA編輯活性。研究者發(fā)現(xiàn),所有測試的C端截短仍然具有功能,能夠恢復(fù)熒光素酶信號(圖S7),最大的截短,C端Δ984-1090(融合蛋白4152bp的總大?。┳銐蛐?,足以適合AAV載體的包裝限制。


REPAIRv1的轉(zhuǎn)錄組特異性

盡管在研究者的熒光素酶平鋪實驗中,用PspCas13b敲除RNA具有高度特異性,但研究者在指南中觀察到脫靶腺苷編輯:靶雙鏈(圖2E)。為了了解這是否是一種普遍現(xiàn)象,研究者平鋪了內(nèi)源性轉(zhuǎn)錄物KRAS,并測量了靶腺苷附近的脫靶編輯程度(圖5A)。研究者發(fā)現(xiàn),對于KRAS,雖然目標(biāo)編輯率為23%,但目標(biāo)站點周圍有許多站點也具有可檢測到的A到I編輯(圖5B)。

由于在指南:靶雙鏈中觀察到了脫靶編輯,研究者最初通過對12.5X覆蓋率的所有mRNA進(jìn)行RNA測序來評估轉(zhuǎn)錄組廣泛脫靶。在轉(zhuǎn)錄組的所有編輯位點中,目標(biāo)編輯位點的編輯率最高,A到I轉(zhuǎn)換率為89%。研究者還發(fā)現(xiàn),存在大量的a到I偏離目標(biāo)事件,1732個偏離目標(biāo)處于目標(biāo)導(dǎo)向條件,925個偏離目標(biāo)位于非目標(biāo)導(dǎo)向條件下,828個偏離靶在目標(biāo)導(dǎo)向和非目標(biāo)導(dǎo)向情況下共享(圖5C,D)。鑒于目標(biāo)導(dǎo)向和非目標(biāo)導(dǎo)向條件之間存在大量重疊的偏離目標(biāo),研究者推斷偏離目標(biāo)可能來自ADARDD。為了驗證這一假設(shè),研究者重復(fù)了Cluc靶向?qū)嶒?,這次比較了REPAIRv1與靶向指南、REPAIRv1和非靶向指南的轉(zhuǎn)錄組變化、單獨的REPAIRv1或單獨的ADARDD(E488Q)(圖S8)。研究者在每種情況下都發(fā)現(xiàn)了差異表達(dá)的基因和脫靶編輯事件(圖S8B,C)。有趣的是,ADARDD(E488Q)和所有REPAIRv1脫靶編輯之間的脫靶編輯事件高度重疊,支持REPAIR脫靶編輯由dCas13b獨立ADARDD編輯事件驅(qū)動的假設(shè)(圖S8D)。

接下來,研究者試圖比較先前描述的兩種RNA引導(dǎo)的ADAR系統(tǒng)(圖S9A)。第一種利用ADAR2DD與小病毒蛋白λN(?N)的融合,λN與BoxB-?RNA發(fā)夾結(jié)合(24)。帶有雙BoxB-?發(fā)夾的引導(dǎo)RNA引導(dǎo)ADAR2DD編輯引導(dǎo)RNA中編碼的位點(25)。第二種設(shè)計利用全長ADAR2(ADAR2)和帶有發(fā)夾的引導(dǎo)RNA,ADAR2的雙鏈RNA結(jié)合域(dsRBD)識別該發(fā)夾(23,26)。研究者分析了這兩個系統(tǒng)與REPAIRv1相比的編輯效率,發(fā)現(xiàn)BoxB-ADAR2和全長ADAR2系統(tǒng)分別顯示了50%和34.5%的編輯率,而REPAIRv1實現(xiàn)了89%的編輯率(圖S9B–E)。此外,BoxB和全長ADAR2系統(tǒng)分別在靶向引導(dǎo)條件下創(chuàng)建了1814個和66個觀察到的偏離目標(biāo),而在REPAIRv1靶向引導(dǎo)情況下創(chuàng)建了2111個偏離目標(biāo)。值得注意的是,兩個基于ADAR2DD的系統(tǒng)(REPAIRv1和BoxB)的所有條件都顯示出其偏離目標(biāo)的高百分比重疊,而全長ADAR2系統(tǒng)具有一組明顯不同的偏離目標(biāo)(圖S9F)。靶向和非靶向條件之間以及REPAIRv1和BoxB條件之間的偏離目標(biāo)重疊表明ADAR2DD獨立于dCas13靶向驅(qū)動偏離目標(biāo)(圖S9F)。

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通過合理的蛋白質(zhì)工程提高修復(fù)的特異性

為了提高REPAIRv1的特異性,研究者采用了ADAR2DD(E488Q)的結(jié)構(gòu)導(dǎo)向蛋白工程。由于非靶點的指南獨立性,研究者假設(shè)破壞ADAR2DD(E488Q)-RNA結(jié)合的穩(wěn)定性將選擇性地減少非靶點編輯,但由于ADAR2DD的dCas13b系鏈(E488Q)到靶位點的局部濃度增加,因此維持靶點編輯。研究者突變了ADAR2DD(E488Q)中的殘基,之前確定其與靶RNA的雙鏈區(qū)接觸(圖6A)(19)。為了評估效率和特異性,研究者使用靶向和非靶向指南測試了17個單突變體,假設(shè)在非靶向條件下背景熒光素酶恢復(fù)將指示更廣泛的脫靶活性。研究者發(fā)現(xiàn),所選殘基處的突變對靶向和非靶向指南的熒光素酶活性有顯著影響(圖6A,B,圖S10A)。大多數(shù)突變體要么顯著提高了靶向?qū)蛭锏臒晒馑孛富钚裕丛黾恿税邢蚺c非靶向?qū)蚧钚缘谋嚷?,研究者稱之為特異性得分(圖6A,B)。

研究者選擇了這些突變體的一個子集(圖6B),通過下一代測序進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組范圍的特異性分析。正如預(yù)期的,從轉(zhuǎn)錄組范圍測序測量的非靶點與研究者的突變體特異性得分相關(guān)(圖S10B)。研究者發(fā)現(xiàn),除ADAR2DD(E488Q/R455E)外,所有測序的REPAIRv1突變體都可以有效編輯報告轉(zhuǎn)錄本(圖6C),許多突變體顯示出非靶點數(shù)量的減少(圖6CC,圖S10C,S11)。研究者進(jìn)一步探索了各種特異性突變體的脫靶周圍基序,發(fā)現(xiàn)REPAIRv1和大多數(shù)工程變體對其脫靶編輯表現(xiàn)出強(qiáng)烈的3'G偏好,與特征化的ADAR2基序一致(圖S12A)(28)。

研究者重點關(guān)注了突變體ADAR2DD(E488Q/T375G),因為它在四個轉(zhuǎn)錄組廣泛靶點數(shù)量最少的突變體中具有最高的編輯百分比,并將其稱為REPAIRv2。與REPAIRv1相比,REPAIRv2表現(xiàn)出更強(qiáng)的特異性,通過高覆蓋測序(125X覆蓋率,10ng DNA轉(zhuǎn)染),轉(zhuǎn)錄組廣泛目標(biāo)從18385個減少到20個(圖6D)。在Cluc中靶向腺苷周圍的區(qū)域,REPAIRv2也減少了脫靶編輯,在測序痕跡中可見(圖6E)。在源自非目標(biāo)位點的圖案中,REPAIRv1表現(xiàn)出對3'G的強(qiáng)烈偏好,但顯示出對所有圖案的目標(biāo)編輯(圖S12B);相比之下,REPAIRv2僅編輯了最強(qiáng)的偏離目標(biāo)圖案(圖S12C)。REPAIRv1的轉(zhuǎn)錄本編輯分布嚴(yán)重扭曲,高度編輯的基因有超過60個編輯(圖S13A),而REPAIRv2只多次編輯一個轉(zhuǎn)錄本(EEF1A1)(圖S13B)。REPAIRv1脫靶編輯被預(yù)測會導(dǎo)致多種變體,包括1000個錯義堿基改變(圖S13C),93個與癌癥過程相關(guān)的基因事件(圖S13D)。相比之下,REPAIRv2只有6個預(yù)測的堿基變化(圖S10E),其中沒有一個在癌癥相關(guān)基因中(圖S13F)。對圍繞REPAIRv1或v2的脫靶編輯的序列的分析沒有揭示與指南序列的同源性,表明脫靶可能是dCas13b獨立的(圖S14),與REPAIRv1和ADAR脫氨酶結(jié)構(gòu)域之間的脫靶高度重疊一致(圖S8D)。為了直接將REPAIRv2與其他可編程ADAR系統(tǒng)進(jìn)行比較,研究者在兩種不同劑量的ADAR載體下對所有系統(tǒng)重復(fù)了研究者的Cluc靶向?qū)嶒?,發(fā)現(xiàn)REPAIRv2具有與BoxB和ADAR2相當(dāng)?shù)陌邢蚓庉嫞趦煞N劑量下,脫靶編輯事件顯著減少(圖S15)。與兩種劑量的REPAIRv1相比,REPAIRv2具有更強(qiáng)的特異性(圖S15B),這一發(fā)現(xiàn)也擴(kuò)展到針對PPIB上不同位點的兩種指南(圖S16A-D)。還值得注意的是,一般而言,較低劑量條件(10ng)的偏離目標(biāo)比較高劑量條件(150ng)的少(圖S5)。

為了以更高的靈敏度評估編輯特異性,研究者在顯著更高的測序深度(轉(zhuǎn)錄組的125X覆蓋率)對REPAIRv1和v2的低劑量條件(10ng轉(zhuǎn)染DNA)進(jìn)行了測序。在與檢測到更罕見的脫靶事件相對應(yīng)的更高測序深度處發(fā)現(xiàn)了更多的脫靶(圖S17)。此外,研究者推測,不同的轉(zhuǎn)錄組狀態(tài)也可能改變脫靶事件的數(shù)量。因此,研究者測試了骨肉瘤U2OS細(xì)胞系中的REPAIRv2活性,分別觀察了靶向和非靶向?qū)虻?個和7個非靶向(圖S18)。

研究者將REPAIRv2靶向內(nèi)源性基因,以測試特異性增強(qiáng)突變是否減少了靶轉(zhuǎn)錄物中的附近編輯,同時保持了高效的靶編輯。對于靶向KRAS或PPIB的指南,研究者發(fā)現(xiàn),與REPAIRv1不同,REPAIRv2沒有可檢測到的脫靶編輯,并且可以有效地編輯目標(biāo)腺苷,效率為27.1%(KRAS)或13%(PPIB)(圖6F)。這種特異性擴(kuò)展到其他靶位點,包括在REPAIRv1的非靶向條件下表現(xiàn)出高水平背景的區(qū)域,例如其他KRAS或PPIB靶位點(圖S19)??偟膩碚f,REPAIRv2消除了編輯腺苷周圍雙鏈區(qū)的脫靶,并顯示出顯著增強(qiáng)的轉(zhuǎn)錄組特異性。


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